О тестах. Подкаст профессора Дростена

Скоро появятся тесты для автоматизированного тестирования иммунитета. А к экспресс-тестам для личного пользования надо относиться с осторожностью

Профессор Кристиан Дростен, руководитель отделения вирусологии берлинской университетской клиники Charite, стал одним из самых популярных в Германии источников информации о новом корона-вирусе и эпидемии и вызываемой им болезни Covid-19. Группа исследователей под руководством Дростена занимается разработкой надежных тестов для выявления вируса, он – один из ученых, которые консультируют федеральное правительство и власти Берлина. Каждый день на радио NDR Info выходит его подкаст, в котором он рассказывает об актуальных исследованиях и новых данных о вирусе, комментирует меры безопасности, развеивает распространенные заблуждения и отвечает на вопросы. С Дростеном разговаривают попеременно научные журналистки Коринна Хенниг и Аня Мартини. Оригиналы всех подкастов можно найти на странице NDR Info.

Мы публикуем сокращенные переводы этих подкастов. Этот выпуск номер 21, он вышел 25 марта. Оригинал здесь.

Здесь выпуски номер 19 от 23 марта и номер 20 от 24 марта. В ближайшие дни мы опубликуем выдержки из некоторых подкастов прошлых дней, информация из которых не потеряла актуальности и сегодня.

Коринна Хенниг
Мы уже несколько раз говорили в этом подкасте о тестах на антитела. На них возлагаются большие надежды, потому что они, возможно, снабдят нас информацией о множестве случаев легкого течения болезни, остающихся незамеченными. И о том, каков уровень иммунитета у населения. Мы также неоднократно говорили о необходимости широкомасштабного тестирования на наличие вируса. Мы хотим затронуть большую тему. В настоящий момент тест на вирус делается с помощью метода ПЦР, что означает полимеразную цепную реакцию. Генетическая информация вируса размножается и вызывает цветовую реакцию. Проще говоря: что именно происходит?

Кристиан Дростен
Это реакция, при которой генетический материал вируса копируется и при этом размножается. Это изобретение конца 1980-х годов, которое заняло прочные позиции в микробиологической и вирусологической диагностике и постепенно вытесняет методы с выращиванием бактериальной или вирусной культуры, в частности, в вирусологии. Это связано с тем, что метод одновременно имеет высокую чувствительность, скорость и высокую специфичность. Специфичность означает, что мы находим в образце для анализа то, что мы там ищем. Это связано с тем, что в реакцию необходимо добавлять небольшие участки ДНК - настоящие физические молекулы, чтобы размножить то, что совпадает с этими молекулами. Если, например, я хочу обнаружить новый коронавирус в полимеразной цепной реакции, то в лабораторных условиях я должен произвести маленькие кусочки этого нового коронавируса в виде РНК, имеющие всего около 20 оснований в длину, и они затем прикрепят себя к геному. И они могут это сделать только в том случае, если они действительно почти или полностью идентичны геному искомого вируса по последовательности оснований. Если там есть еще один вирус, который имеет небольшое сходство, но на самом деле это другой вирус, то он обнаружен не будет.

Коринна Хенниг
Это означает, что присутствие других коронавирусов не приведет к ложноположительным результатам?

Кристиан Дростен
Точно. Четыре коронавируса, которые вызывают у человека простуду, с помощью этой операции обнаружены не будут. Мы этого и не хотим. Мы хотим, чтобы тест был положительным только в том случае, если действительно присутствует новый вирус.

Коринна Хенниг
То есть тест показывает именно наличие вируса, а не иммунный ответ пациента. Значит, если я делаю тест слишком поздно, когда еще есть симптомы, но болезнь уже утихает, то тест не покажет ничего?

Кристиан Дростен
При этом заболевании в первую неделю проявления симптомов взятые из горла мазки при тестах ПЦР дают надежные положительные результаты . На второй неделе - уже нет. У пациента все еще есть симптомы, но в горле тест может уже ничего не показать. Это не потому, что тест плохой, а потому, что вируса больше нет в горле, зато теперь он присутствует в легких. Теперь мы знаем, что даже у пациентов с очень мягким течением, которые практически не замечают свою болезнь, в легких все еще остается довольно много вируса. В легких случаях это длится около двух, а то и трех недель. Все это время мы можем обнаружить вирус в легких с помощью ПЦР. Однако многим пациентам не так просто выкашлять образец из легких, поэтому чаще всего берут на анализ мазки из горла. Еще можно сделать анализ кала, хотя эта практика пока не очень распространена. Вирус обнаруживается там тоже, и почти так же долго, как в легких. 

Коринна Хенниг
Но он не заразный, мы уже упоминали это в подкасте. Фекально-оральным способом, как, например, норовирусы, коронавирус не передается.

Кристиан Дростен
Да, верно. Вирус хорошо выявляется в стуле, это можно использовать в качестве диагностической информации. Но он не похож на заразный вирус. Мы можем это утверждать потому, что параллельно мы выращиваем культуру клеток из того же образца, а затем смотрим, вырастет ли там живой вирус. Этого не происходит.

Коринна Хенниг
Вернемся к мазку из горла, это рутинная процедура. Иногда по телевизору показывают, как людям выдают тестовый набор, и они сами берут мазок из горла прямо у себя в машине. Насколько важно, чтобы этот тест был выполнен правильно? Насколько глубоко вообще требуется залезать в горло?

Кристиан Дростен
Нужно добраться до задней стенки глотки, тут есть два варианта. Один из них - пройти через нос с палочкой-тампоном вдоль нижней стенки полости носа, это больно до слез. [...] А другой путь гораздо удобнее: прямо через рот. [...] Если открыть рот и посмотреть в зеркало, там вы увидите мягкое нёбо [...] и язычок, мазок нужно брать за ним. Там нужно потереть, чтобы получить материал со слизистой - верхний слой соскобленных клеток должен прилипнуть к тампону, потому что в нем много остатков вируса. 

ПРАКТИЧЕСКИ НЕТ ЛОЖНООТРИЦАТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Коринна Хенниг
Значит, если тест через горло плохо выполнен, он иногда может дать ложноотрицательный результат, несмотря на высокую чувствительность?

Кристиан Дростен
К счастью, есть хороший запас диапазона чувствительности. Думаю, довольно маловероятно, что вирус не смогут обнаружить вообще. Особенно, если брать два мазка, как и делается с большинством пациентов. Так достигается статистическая уверенность - если один из мазков не вышел, берете второй. И тогда шансы довольно высоки.

Иногда в видео или на фотографиях о том, как брать мазок из носа, тампон просто вставлен в ноздрю. Создается впечатление, что достаточно взять немного жидкости в передней части ноздри, но это, конечно, не так. Придется пройти через весь нос, чтобы достать до глотки.

Коринна Хенниг
Пока не станет больно, тогда ясно, что все сделано правильно.

Кристиан Дростен
К сожалению, сам процесс тоже довольно болезненный. 

Коринна Хенниг
[В Германии тесты проводятся с очень разной скоростью]. Тем не менее, по количеству тестов Германия значительно опережает остальную Европу. Как вы думаете, мы сможем в какой-то момент протестировать более крупную выборку населения?

Кристиан Дростен
Конечно, у людей бывает впечатление, что им приходится ждать вечно. [...] Но у меня также есть ощущение, что громче всех раздаются голоса недовольных, тех, кому пришлось ждать. Не думаю, что кто-нибудь напишет в твиттере: "Все прошло здорово, я сразу же получил результаты ПЦР". Но я могу сказать, что такое бывает, это норма. Я имею в виду, что большинство пациентов получают результаты не позднее, чем на следующий день. [...] В сельской местности это длится на сутки дольше из-за транспортировки. [...] И у нас в Германии проводятся очень много тестов, у нас для этого большие ресурсы. Все, кто может оценить цифры и кто знает, каковы цифры в других странах, убеждены (и я в том числе), что причина, по которой в Германии сейчас такой низкий показатель смертности среди протестированных, заключается в том, что мы очень многих тестируем. 

У нас чуть более 31 000 случаев и около 160 смертей, а это всего 0,5 процента. Это немного выше, чем на прошлой неделе […] И, конечно, мы медленно входим в область, в которой мы, возможно, не сможем удержать экспоненциальный рост числа заболевших. За последние два-три дня каждый день появлялось множество новых случаев. Но их количество в день за последние несколько дней не росло. Это интересно.

ВОЗМОЖНО, МЕРЫ УЖЕ ДЕЙСТВУЮТ

И я думаю, что [...] реализуемые изоляционные меры уже оказывают свой эффект, всего спустя неделю с небольшим. И это тоже объясняется тем, что мы рано начали распространять эту диагностику, и много лабораторий с января используют этот метод. Вот почему мы так быстро видим этот эффект.

Коринна Хенниг
Что касается эффективности мер: вы сказали, посмотрим, что будет к Пасхе, и тогда политики будут решать, нужно ли что-то корректировать. Для этого бы неплохо иметь больше данных. Есть ли возможность протестировать случайную выборку, чтобы выявить больше случаев скрытой инфекции? 

Кристиан Дростен
В данный момент ПЦР-диагностику не делают на случайной выборке. В настоящее время слишком много пациентов, у которых действительно есть причина для тестирования. И поэтому имеющиеся у нас мощности уже полностью загружены. В самом ближайшем будущем, а это на самом деле гораздо важнее и информативнее, станут проводиться такие случайные тесты на антитела. Это совершенно другая процедура тестирования. Когда человек заражается, проходит около десяти дней, прежде чем вырабатываются антитела. Это и по нашим данным, и по данным других исследований. Эти антитела становятся заметнее в последующие дни. В начале их уровень низкий. Через две-три недели после заражения в крови человека антитела присутствуют совершенно явно. На образце крови можно провести анализ с помощью технически другого типа тестов - это т. н. тесты ELISA, иммуноферментные анализы для проверки наличия антител в крови пациента, независимо от формы, в которой у него протекала инфекция. 

Именно об этом мы на самом деле и размышляем. Если бы мы знали, что все инфекции протекают с симптомами, можно было бы сказать, что мы довольно точно регистрируем имеющиеся случаи с точки зрения результатов ПЦР, и можем делать расчеты на этой основе. Однако чего мы пока не знаем (и в других странах [...] пока нет исследований и убедительных данных по этому поводу), так это количества абсолютно бессимптомно зараженных в популяции. Каково побочное иммунизирующее действие этого вируса? Сколько людей заражаются, не замечая этого или не придавая симптомам значения, потому что у них всего лишь слегка першит в горле? Но у них, тем не менее, есть антитела, и, как предполагается, иммунитет, и в таком случае они вносят свой вклад в те 60 или 70% населения, которые должны приобрести иммунитет или заразиться для того, чтобы волна пандемии остановилась.

Коринна Хенниг
Потому что мы приобретаем коллективный иммунитет.

Кристиан Дростен
Точно, это необходимый нам коллективный иммунитет. И, конечно, в его формировании участвуют те, кто приобрел иммунитет бессимптомно. Мне нравится старый медицинский термин "латентная иммунизация”. Она может происходить совершенно незаметно, и мы не знаем, какой процент населения ей затронут. В настоящее время по всей Германии проводятся исследования, чтобы выяснить это. В дополнение к данным о зарегистрированных случаях, т.е. о подтвержденных при помощи ПЦР и о смертях, это будет третьей крупной информационной составляющей, получаемой на основе лабораторных анализов, которая необходима нам для эпидемиологического моделирования и оценки ближайшего будущего. Это сделает картину, которую рисуют эпидемиологи, намного более точной. В принципе, эти тесты на антитела  были разработаны буквально только что. И очень немногие компании сейчас в состоянии предложить такой тест и поставлять его в больших количествах. Лабораториям потребуется время, чтобы подготовиться к массовому тестированию.

АНАЛИЗ НА АНТИТЕЛА В ЛАБОРАТОРИИ ДЕЛАЮТ УЖЕ ДВА МЕСЯЦА

Однако уже сейчас существует возможность проведения таких тестов на антитела в лабораторных условиях в малых масштабах. С середины января мы можем проводить тесты на антитела этого вируса в нашей лаборатории. Это иммунофлюоресцентный тест. [...] Это работает так: мы берем клеточную культуру и заражаем ее вирусом. Прежде чем клетки окончательно умрут и лопнут, мы останавливаем инфекцию. Клетки будут полны белков вируса. Мы либо выращиваем клетки с самого начала на предметных стеклах, на которые потом можно посмотреть под микроскопом, либо наклеиваем их туда позже. [...] Потом мы сушим эти стекла. Образуется очень тонкий слой распавшихся клеток, и вирусный белок становится отчетливо виден, по сути белок нуклеокапсида, внутренний строительный белок. Он производится вирусом в больших количествах. И это главный антиген в иммунофлуоресцентных тестах, против которого у пациентов уже есть антитела. Сыворотку пациента можно поместить на предметное стекло и смыть. Если в ней есть антитела к вирусу, то эти специфические антитела приклеятся к его белкам. Их, в свою очередь, можно обнаружить на стекле с помощью других антител, покупных. Это, например, антитела против иммуноглобулина человека, являющиеся классическим зеленым флуоресцентным красителем. Под флуоресцентным микроскопом мы видим, что эти клетки светятся зеленым светом, если у пациента есть антитела. Подготовить такие предметные стекла достаточно сложно, уходит много времени. [...] Сотрудник лаборатории изучает их под микроскопом. Иногда мы разводим сыворотку 1:10 или 1:100, чтобы проверить, много ли в ней антител. Эта ручная работа занимает много времени.

АВТОМАТИЗИРОВАННОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ УЖЕ БЛИЗКО

Для массовых обследований, где мы хотели бы протестировать тысячи пациентов, например, из одного города или возрастной группы, это просто невозможно. Нам нужен автоматический тест ELISA, а они пока еще только в стадии подготовки.

Коринна Хенниг
Но они еще только разрабатываются. Вы участвуете в их валидации? Уже есть предварительно опубликованные исследования по тестам ELISA.

Кристиан Дростен
Да, есть крупный известный немецкий производитель, которому мы с самого начала помогали как в разработке, так и в оценке этих методов тестирования. [...] Наши лабораторные тесты требуют много усилий, но мы точно знаем, как они работают, в то время как в результате теста ELISA на выходе мы получаем только цветовое значение. Вот почему нужно провести валидационные исследования. Но они уже завершены и выглядят хорошо. Так что мы можем подтвердить этому производителю: "Давай, начинай их производить, чтобы все могли их использовать". Разумеется, такие исследования сейчас проводятся и во многих других странах, другие производители также спрашивают нас, можем ли мы помочь им валидировать тесты. И, конечно, мы это делаем.

Коринна Хенниг
Принципы тестов ELISA знакомы многим по тестам на аллергические реакции. Вы только что говорили про количество антител. Насколько важно, сколько антител вырабатывается? И все ли люди вырабатывают примерно одинаковое количество антител?

Кристиан Дростен
Все люди попадают примерно в один диапазон. Мы говорим о титрах, это показатели разведения. Допустим, лабораторный тест положителен на сыворотке, и нам надо посмотреть, положителен ли он и при разбавлении сыворотки - например, 1:2. И если она все еще положительна, можно спросить: по-прежнему ли она положительна, если разбавить ее 1:4? Потом 1:8, 16, 32, 64 и так далее, 128, до тысячных. Последовательность разведений можно протестировать и прийти к выводу о том, на какой стадии разбавления тест перестает быть положительным. Показатель разведения, до которого тест еще положительный, и есть титр. Это наша мера уровня антител. При внимательном рассмотрении нельзя сказать, что у пациента, титр у которого в два раза выше, чем у другого, также ровно в два раза больше антител в сыворотке крови. Потому что все не так просто. Это не просто измерение концентрации, но и измерение силы реакции связывания.

АНТИТЕЛА ОПТИМИЗИРУЮТСЯ СО ВРЕМЕНЕМ

Вполне возможно, что у одного пациента в крови точно такая же концентрация антител, как у другого, но титр в два раза выше. Это происходит потому, что антитела у этого пациента связываются с вирусом гораздо лучше, сильнее. Почему так? На этот вопрос есть интересный ответ. В начале формирования иммунных реакций иммунная система производит отдельные липкие антитела, которые могут связываться со всеми видами белков. Но потом дело доходит до процесса, который мы называем "созреванием авидности". Авидность, это такой термин, его нельзя перевести просто как прочность связывания, в нем заключены несколько физических свойств. Возможно, лучший способ перевести это слово - "жадность". Итак: насколько жадным является такое антитело к белку патогена? С какой жадностью он связывает этот патоген? Эта жадность увеличивается в сроки от нескольких дней до нескольких недель после заражения. Свежие антитела обладают низкой авидностью. По прошествии двух или трех недель антитело будет обладать высокой авидностью. Оно особенно голодно до белков этого вируса. 

Это, в конечном счете, процесс биологической оптимизации, где предпочтение отдается определенным клонам антител-продуцирующих клеток. И они постоянно проверяются во время ликвидации болезни. Потом они получают преимущество в отборе и одерживают победу. Важнее всех в итоге те клетки по производству антител, которые делают лучшие антитела. Именно поэтому через определенное время после заражения у пациента есть особо авидные антитела.

Это один из аспектов. Видите, это превращается в лекцию.

Коринна Хенниг
Мы жадны до знаний. Мы тоже хотим учиться.

Кристиан Дростен
Итак, что касается одного аспекта вашего вопроса, каковы различия в иммунных ответах? Это титр и стоящая за ним авидность. Но у нас есть и кое-что еще. Антитела могут каким-то образом связываться с патогеном, связываться с любым белком в вирусе. Или они могут связываться с функционально важным местом. Допустим, вирус должен попасть в клетку и для этого он должен, например, связаться с рецептором клетки. Иначе вирус есть, но он не может попасть внутрь и поэтому не оказывает никакого влияния на наше здоровье. И есть антитела, которые связываются где-то на поверхности вируса. И мы измеряем их количество в тесте ELISA. Но среди этих антител есть несколько таких, которые поражают именно слабое место патогена, например, путем связывания с тем местом белка оболочки, которым вирус хотел связаться с рецептором клетки на входе.

Коринна Хенниг
То есть, особенно эффективные антитела?

Кристиан Дростен
Именно, антитела, особенно сильно мешающие инфекции. Мы говорим, что они нейтрализуют заражение, и называем их нейтрализующими антителами. Чтобы выделить их, учитывая большой фон общих антител, мы должны провести еще один лабораторный тест, т. н. тест нейтрализации. Он работает так, что мы проверяем, как предотвращается возникновение инфекции в сыворотке данного пациента. Мы берем лабораторный вирус и смешиваем его с клеточной культурой в процессе одной реакции. А в сравнительной реакции, - это фактическая тестовая реакция, - мы сначала добавляем сыворотку пациента. Если в этой сыворотке содержатся антитела, связывающиеся именно с нужными местами, то мы при таком сравнительном подходе увидим, что инфекция не начнется - тогда как при первоначальном подходе, как и ожидалось, клетки заразятся, а вирус размножится. [...] Можно отдельно определить титр нейтрализующих антител, и этот уровень не обязательно совпадает с общим. 

ИММУННЫЙ ОТВЕТ НА РАЗНЫХ УРОВНЯХ

Есть пациенты, у которых имеется высокий титр нейтрализующих антител, но слабый общий титр антител, такие комбинации существуют. И есть обратный случай - пациенты, которые производят довольно много антител, но титр нейтрализующих антител у них низкий. Почему это так, мы не знаем. Существует много различий между отдельными людьми.

Коринна Хенниг
Какое значение это имеет для тестирования? Я говорю сейчас об обычных людях или о сотрудниках клиник, которых будут тестировать, когда появятся автоматизированные тесты ELISA.

Кристиан Дростен
Тесты ELISA - единственное, что можно использовать в ежедневной работе. Когда надо узнать, прошла ли уже у человека инфекция, возникшая естественным путем. Следует поговорить и о том, что тесты на антитела также используются в ситуациях вакцинации. Но с естественной инфекцией единственное, что мы хотим знать - была она или нет? Да или нет? И простого теста ELISA для этого достаточно. 

ДЛЯ ТЕСТОВ НА АНТИТЕЛА ДОСТАТОЧНО ПРОСТЫХ ОТВЕТОВ

В течение естественной инфекции ответ антител не обязательно убивает вирус напрямую, скорее, это происходит на совершенно другом уровне иммунной системы, а именно на уровне клеточного иммунного ответа. И мы измеряем это через антитела лишь косвенно. 

Есть две системы клеточного ответа. Одна из них - Т-хелперы, другая - Т-эффекторы. Хелперы также помогают В-клеткам, производящим антитела и призванным хранить память. И эти глубинные слои иммунной реакции, т.е. два типа Т-клеток, нельзя достоверно протестировать простым тестом на антитела. Их, конечно, можно протестировать в лаборатории, но эти тесты намного сложнее, чем простой анализ на антитела. [...] Для ответа же на вопрос, прошла ли уже инфекция, простого анализа достаточно. Из этого мы также можем сделать вывод, что у пациента будет иммунитет.

ТЕСТИРОВАНИЕ НА АНТИТЕЛА ВАЖНО ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ ВАКЦИН

Конечно, есть ситуации, в которых хочется точнее узнать, была ли простимулирована та или иная деятельность иммунной системы. Например, исследования в области вакцин, где необходимо точно знать, вызван ли сильный титр нейтрализующих антител также и вакциной. […] Такие исследования проводятся сначала на лабораторных животных, а затем на людях.

Коринна Хенниг
Значит, мы возвращаемся к принципу пассивной иммунизации с использованием антител от людей, уже переживших болезнь?

Кристиан Дростен
Ну, вообще-то я как раз говорил об активной иммунизации, о тестировании активных вакцин. Там требуется узнать, какие реакции вызывает такое исследование у тестируемого. Например, развивается ли у него хороший нейтрализующий иммунный ответ после вакцинации? И, конечно же, надо проверить и другие отделы иммунной системы. Хороший ли Т-клеточный ответ? Хорошая ли у него память? То есть, будет ли хороший ответ Т-хелперов, и надолго ли останутся B-клетки? Такие вещи уточняют прямыми или косвенными тестами в специальных исследованиях вакцинации.

АКТИВНЫЕ ВАКЦИНЫ И ПАССИВНАЯ ИММУНИЗАЦИЯ

Раз уж мы об этом заговорили. Конечно же, с этим заболеванием есть идея проведения пассивной иммунизации, например, путем донорства плазмы крови от выздоровевших пациентов. И, конечно же, в отдельных случаях, например, в случае донорства плазмы тяжело больному пациенту в надежде на то, что это устранит вирус - в случае такой сыворотки будет проведен тест на нейтрализацию вируса в лаборатории, будет проверено, действительно ли эта донорская кровь нейтрализует вирус. 

Коринна Хенниг
Тема разработки вакцины очень велика, и мы, безусловно, еще раз обсудим ее в другом эпизоде [...] Вы сказали, что через два-три месяца, по вашему мнению, можно будет проводить автоматизированные тесты на антитела. Но это же не будет устроено так, что я смогу прийти в аптеку и сказать: вот, я хочу отвести детей к бабушке и дедушке, а они немного кашляли дома в нашей добровольной изоляции, и мне его просто продадут? Так для кого эти тесты на антитела предназначены в первую очередь?

Кристиан Дростен
[Наша и многие другие лаборатории уже устанавливают оборудование для массовых автоматизированных тестов, так что ждать два-три месяца не придется]. Эти тесты можно будет сделать у терапевта, [который перешлет и в лабораторию], и получить результат на следующий день. Они будут давать ответ на вопрос, прошла ли уже инфекция. [...] Кроме того, тест пригодится при ответе на вопрос касательно персонала клиник. Может ли этот врач или медсестра снова работать с пациентами, используя меньше средств защиты из-за наличия иммунитета? Или в амбулаторном уходе… 

Сейчас на рынке появляются тесты на антитела, которые станет можно купить самому. Возможно, вскоре они появятся в аптеках, они уже сейчас есть на Ebay. Эти тесты еще не валидированы, они поступают в основном из Азии, особенно из Китая. Они также проверяют наличие антител, но используют другой принцип тестирования. На данный момент я должен сказать, что к ним следует относиться с осторожностью [...]. Тем не менее, сейчас мы проверяем такие тесты от нескольких производителей и даем обратную связь о том, насколько хорошо они работают. В ближайшие недели мы обязательно увидим первые публикации о том, насколько хорошо работают такие быстрые тесты на антитела. [...]

Перевод: Ольга Улькова

Назад

больше новостей